鼠单克隆抗体高通量筛选平台
一、核心技术介绍
思格生物在传统杂交瘤筛选方法上进行了技术迭代升级，突破原有技术的诸多局限，全面提升了抗体筛选的通量和效率。具体利用自主开发的抗体靶向膜锚定技术，将抗体专一性锚定在分泌该抗体的杂交瘤细胞表面，进而利用抗原荧光染色和流式细胞仪分选，可将分泌阳性抗体的杂交瘤细胞分选至96孔板或384孔板，直接获得抗体单克隆细胞，这一操作过程避免了传统杂交瘤技术繁琐的亚克隆工作，大幅度节约时间和成本，同时将抗体筛选通量提高2~3个数量级。
另外我们开发了强效小鼠免疫佐剂，可在短时间内免疫小鼠并获得超高血清效价、使小鼠体内产生高峰度和多样性的抗体序列。同时在电融合上实现了单只鼠融合获得百万数量级杂交瘤的效率，理论上通过强效免疫和卓效电融合的组合，可覆盖获得小鼠体内95%以上的识别目标抗原的抗体序列。融合后的百万级别数量的杂交瘤通过流式分选，可短时间内获得100~500株强阳性抗体，这些抗体有效用于后续抗体活性评估，从中筛选获得有目标生物活性的抗体分子。
二、抗体筛选流程
三、技术特色
➢ 动物免疫效果好：自主开发的强效动物免疫佐剂，可有效保护抗原结构并显著提高血清效价抗体滴度；
➢ 筛选通量高：根据项目需要，可交付100 ~ 500株 ELISA阳性单克隆杂交瘤上清, 用于后续筛选和评估；
➢ 筛选周期短：较快10周交付杂交瘤上清。
➢ 检测评估体系完善：可完成抗体Elisa 检测、FACS检测、亲和力检测、抗体表位分组分析、抗体中和活性&抑制活性分析等多项分析及检测。
四、不同抗体筛选平台比较
五、筛选案例 1
➢ 小鼠免疫
该项目靶点免疫方式为FC 融合重组蛋白作为抗原，对小鼠进行四次免疫，免疫佐剂为思格生物自主开发的PAP-1强效免疫佐剂，最后一次免疫采血检测，结果显示，血清效价大于1:12.8万，免疫效果满足要求，进行后续融合。
➢ 杂交瘤融合及ELISA检测
取效价高的4只小鼠脾脏、混合研磨并制备单细胞，将其与SP20细胞混合，利用电融合仪融合，融合后细胞在HAT 培养基中培养，培养数天后，存活克隆数大于400万；将上述存活下来的杂交瘤细胞，细胞进行FACS 抗原染色并做单细胞分选至18块96孔板，培养一周后，经ELSIA鉴定，获得约1300株ELSIA阳性单克隆杂交瘤。
➢ 阻断ELISA 检测
在上述筛选到的1300株阳性杂交瘤上清中，有94株杂交瘤上清有较强的抑制抗原与自身受体的结合能力
六、筛选案例 2
为了验证该平台筛选抗体序列的多样性，如下项目为利用思格生物自主开发的强效免疫佐剂PAP-1免疫小鼠，通过高通量筛选平台筛选得到的、同时具备ELISA 结合和FACS强结合能力的抗体序列，总计205个抗体，通过序列测序和对其CDR3 长度和 germline 使用频率统计分析，该平台开发的抗体多样性良好。
亲和力检测
对部分抗体进行亲和力检测，该技术平台可以筛选到高亲和力的鼠单克隆抗体
|
Loading Sample ID |
KD (M) |
KD Error |
Full R^2 |
|
AB-2-B3 |
1.07E-12 |
7.85E-12 |
0.9482 |
|
AB-1-E10 |
1.36E-12 |
4.38E-12 |
0.9904 |
|
AB-1-H1 |
1.47E-12 |
4.53E-12 |
0.99 |
|
AB-Black2-B11 |
1.48E-12 |
1.84E-12 |
0.9985 |
|
AB-1-B10 |
1.55E-12 |
1.61E-11 |
0.9121 |
|
4F8-1-E9 |
1.61E-12 |
3.37E-12 |
0.9958 |
|
AB-2-G11 |
2.17E-12 |
2.35E-11 |
0.8996 |
|
AB-1-G8 |
2.87E-12 |
1.74E-11 |
0.9671 |
|
AB-1-G9 |
4.16E-12 |
1.82E-11 |
0.9823 |
|
AB-1-G7 |
5.65E-12 |
3.77E-11 |
0.9631 |
|
AB-1-F3 |
1.16E-11 |
7.23E-11 |
0.9701 |
|
AB-Black1-G6 |
5.12E-10 |
1.50E-11 |
0.9987 |
|
3E2-1-G3 |
2.16E-09 |
5.68E-11 |
0.9882 |